本篇内容将适合比较关注前沿技术的酿酒师食用

缬氨酸生物合成条件与步骤

酵母的生长是整个酿造过程中至关重要的一环。假如酵母的健康情况不佳，轻则产生大量的不良风味，重则酵母死亡，导致无法发酵。缬氨酸用于蛋白质的生物合成，在营养学上，它是人类的必要氨基酸。当然，对于酵母也不例外。

缬氨酸的生物合成

要了解双乙酰的生物合成，必须要回归到整个缬氨酸的生物合成（Valine Biosynthesis）。先为大家简单介绍一下整个过程首先。

• 丙酮酸（Pyruvate）在由ILV2基因（其中角色为催化亚基，提供酶的催化功能）和ILV6基因（其中角色为调节亚基，负责酶的活性）共同编码成的乙酸乳酰合成酶（α-acetolactate Synthase）作用下，合成α-乙酰乳酸，并释放二氧化碳。

• 第二步，由α-乙酰乳酸转化为2,3-二羟基异戊酸（2,3-dihydroxy-isovalerate）。该反应需要NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原形式，反应中的辅酶，NADPH经常参与到各种生物合成中，作为反应中的还原剂）和带正电荷的氢离子参与反应。通过由ILV5基因编码的乙酰羟酸还原异构酶（acetohydroxyacid reductoisomerase）作用，合成2,3-二羟基异戊酸并释放NADPH的氧化形式NADP+。

• 第三步。2,3-二羟基异戊酸在由ILV3基因编码的二羟酸脱水酶（dihydroxy-acid dehydratase）作用，转化为2-酮异戊酸（2-keto-isovalerate），并释放水分子。

• 第四步。2-酮异戊酸转化为缬氨酸，需要L-谷氨酸（ L-glutamate）（谷氨酸一般存在麦芽汁的游离氨基酸里）参与反应，最终释放缬氨酸和2-氧戊二酸盐（2-oxoglutarate）。其中需要有BAT2编码的支链氨基酸转氨酶（branched-chain amino acid transaminase）和BAT1编码的支链氨基酸氨基转移酶（branched-chain amino acid aminotransferase）参与到其中。

乙偶因的生物合成

除此之外，我们再了解下乙偶因的生物合成（Acetoin Biosynthesis）过程。

• α-乙酰乳酸转化为双乙酰，上篇提到这是一个非酶氧促脱羧反应。在较高的PH值和温度下，会自然地反应。

• 双乙酰转化为乙偶因。这个过程，可以理解为有发酵液/麦芽汁中的游离双乙酰，重新被细胞利用。通过BDH1基因编码的双乙酰还原酶(Diacetyl Reductase)，双乙酰，在NADH辅酶参与反应下，转化为乙偶因和NAD。

在了解以上的过程后，其实可以了解到，关乎α-乙酰乳酸的生物合成部分，只占缬氨酸的生物合成的前两步。第一步合成，第二步就降解。在某些工业啤酒生产线上，需要维持一直的低温，做双乙酰休止似乎并不实际。所以减少双乙酰的产生，就一定要解决α-乙酰乳酸的问题。在生物应用上，会采用三种方式：提高最终产物含量、添加各种酶、基因工程。

生物干预手段

提高最终产物含量

提高最终产物含量，可以简单理解为，为酵母提供一个有足够的缬氨酸的发酵环境。论文《Influence of valine and other amino acids on total diacetyl and 2,3-pentanedione levels during fermentation of brewer’s wort》中指出添加了缬氨酸的对照组比控制组产生更少的双乙酰。

添加不同浓度的缬氨酸，对双乙酰的影响

来源：Influence of valine and other amino acids on total diacetyl and 2,3-pentanedione levels during fermentation of brewer’s wort

同时该论文还指出，当在减弱的FAN（Free Amino Nitrogen，游离氨基氮，是形容发酵环境中所含氨基酸含量的标准）环境中添加缬氨酸效果更明显。原因是FAN中，含有比缬氨酸摄取率（Uptake rate）更高的其他氨基酸，尽管酵母会一直生产缬氨酸，但是在生长期的12小时后才会是缬氨酸的快速吸收期。

以缬氨酸为基准的，其他氨基酸的变化值

来源：Influence of valine and other amino acids on total diacetyl and 2,3-pentanedione levels during fermentation of brewer’s wort

减弱 FAN（含氨基酸 204ppm）比标准 FAN（含氨基酸 408ppm）产生更少双乙酰

来源：Influence of valine and other amino acids on total diacetyl and 2,3-pentanedione levels during fermentation of brewer’s wort

另一方面，在其他研究中观察到，高浓度的缬氨酸会抑制乙酸乳酰合成酶。这可能与ILV6（即上文提到的乙酸乳酰合成酶的基因调节亚基）自身反馈调节相关，过高浓度会优先抑制缬氨酸的生物合成。

综上，添加最终产物缬氨酸的优点就是可以在不改变原发酵过程下，减少双乙酰的产生。缺点就是，成本高，而且有可能会提升预期的醇类及酯类副产物。该论文也提到添加高浓度缬氨酸及其他氨基酸导致的芳香物质浓度变化。

单独的两次发酵，第一次对照组先投放比缬氨酸摄取率低的氨基酸，再添加亮氨酸和异亮氨酸；第二次对照组直接添加比缬氨酸摄取率高的氨基酸。两次检测皆有不同风味物质的变化

来源：Influence of valine and other amino acids on total diacetyl and 2,3-pentanedione levels during fermentation of brewer’s wort

基因工程

由于乙偶因的生物合成仅仅与缬氨酸生物合成的前两步有关联。所以思路就是，在缬氨酸的生物合成过程，干扰ILV2/ILV6的表达（减少α-乙酰乳酸的合成）；增强ILV5的表达（加强由α-乙酰乳酸转化为2,3-二羟基异戊酸）；在乙偶因的生物合成过程，增加BDH1的表达（加强双乙酰到乙偶因的转化）。

天津大学的一项研究表明，干扰ILV2的等位基因（QI2）；干扰ILV2同时增BDH1（QI2GB1）；增强BDH1（B1Y），均对双乙酰的产生有影响。

基因被修改的酵母与普通酵母（S2）的双乙酰含量（发酵 16天）

来源：Diacetyl content reduction in industrial brewer’s yeast through ILV2 disruption and BDH1 expression

天津大学的另一个研究，删除了其中一条ILV2等位基因的酵母（QI2-KP）；删除一条ILV2等位基因，同时增强BDH2（与BDH1的功能类似）的酵母（QI2-B2Y）；删除一条ILV2等位基因，同时增强ILV5的酵母（QI2-I5Y）。在发酵过程，QI2-I5Y的效果最明显。

基因被修改的酵母与普通酵母（S2）的双乙酰含量（发酵 16天）

来源：Diacetyl content reduction in industrial brewer’s yeast through ILV2 disruption and BDH1 expression

以上的实验反映了，对生物合成中涉及的基因进行干预，能够比较有效地达到理想的双乙酰控制效果。基因工程的方法的优点就是一旦菌株培育完成，便可以大规模生产，不需要另外的投料。只是干扰基因是否可能其他潜在的问题，还需要持续观察。

添加对应的酶

与基因工程不相同的是，额外添加酶是为了更好的可控性，并且可以在其他阶段来实现针对性的双乙酰合成降解。不过，不像基因既可以干扰又可以增强，外源性酶只能使环境酶含量提升，而非下降（除非使用失活的方式，但这几种酶的失活条件比较苛刻）。

根据上面的过程，我们可以知道。

• 添加外源性乙酰羟酸还原异构酶，来加速乙酰乳酸转化为2,3-二羟基异戊酸的过程，以防止乙酰乳酸大量游离到细胞外部。

• 添加外源性双乙酰还原酶，加速双乙酰到乙偶因的过程。

比较遗憾的是，暂时没有找到采用添加外源性乙酰羟酸还原异构酶的方法去减少双乙酰的研究。而对双乙酰还原酶对发酵环境双乙酰含量的影响的研究符合预期。

不同浓度的双乙酰还原酶对双乙酰的影响

来源：Enzymatic Removal of Diacetyl from Beer1 III. Enzyme Protection and Regeneration of Cofactor

然而，在工业应用上，使用得最多的并不是双乙酰还原酶，而是使用ALDC（Alpha Acetolactate Decarboxylase，乙酰乳酸脱羧酶）。ALDC已经是大工厂必备的一种工业用酶。ALDC直接催化α-乙酰乳酸转化为乙偶因和二氧化碳，中间跳过了双乙酰的生成。

α-乙酰乳酸转化为乙偶因和二氧化碳

该酶比以上提到的两种酶好的地方在于，跳过了中间产物双乙酰的产生，从根源上根除了双乙酰。AB Vickers生产的ALDC，其说明讲到：只需要在加入到冷却的麦芽汁里加入即可。

只需加入到已经冷却至发酵温度的麦芽汁里即可

而ALDC价格方面，某宝上的定价真的便宜，每1000L才0.25元左右。对于工厂而言，绝对是一笔小数目。

本章，我们讨论了在生物工程层面，如何去抑制双乙酰的产生。下一章，会简单介绍一下一些其他的双乙酰抑制技术，包括固定酵母法，麦芽品种优选等。本篇特别鸣谢远在澳洲昆士兰大学攻读硕士的 Lydia 提供的论文资源帮助。

参考文献：

《Influence of valine and other amino acids on total diacetyl and 2,3-pentanedione levels during fermentation of brewer’s wort》

《Enzymatic Removal of Diacetyl from Beer1 III. Enzyme Protection and Regeneration of Cofactor》

《125th Anniversary Review: Diacetyl and its control during brewery fermentation》

《High-level production of valine by expression of the feedback inhibition-insensitive acetohydroxyacid synthase in Saccharomyces cerevisiae》

《Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi》

Saccharomyces Genome Database 

https://www.yeastgenome.org/

BRENDA

http://www.brenda-enzymes.org